研究报告

项目名称：大麻叶提取物（全谱大麻二酚/全谱CBD）介导牙周炎治疗的实验室研究

委托单位：

甲方：云南汉木森生物科技有限责任公司

受托单位：四川大学

项目负责人： （签字）

年 月 日

说 明

1. 项目负责人本着认真负责的态度，公正、客观的按照研究方案进行实验并填写本报告。

2. 本报告必须有项目负责人签字。

3. 未经四川大学和四川大学华西口腔医（学）院书面许可，不得在产品包装和宣传资料（包括对外公开会议手册、产品介绍光盘、商场海报等资料）上出现“四川大学华西口腔医学院验证”等字样。

4. 本研究报告的数据仅针对送检产品的试验结果。

一、 研究目的：

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，其严重的炎症反应和牙周组织的破坏，是导致牙齿脱落的主要原因。纯大麻二酚（CBD）和全谱CBD油的抗炎特性已多有报道，在不同器官中，影响到各种疾病的发病机理。本研究通过在实验性牙周炎模型中外用全谱CBD油，探讨它的抗炎效果，同时研究全谱CBD油对人牙周膜干细胞的保护作用及其抑制炎症的机制，初步探讨它对牙周炎的治疗作用。

二、 研究/实验方法：

在实验性大鼠牙周炎模型上，外用涂抹大麻二酚，收集上颌标本，运用Micro CT扫描、重建，以各标本第二磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离（CEJ-AC）和骨密度骨体积分数比为骨形态学测量指标，同时用酶联免疫吸附试验检测大鼠牙周组织中炎症相关蛋白TNF-α、IL-1、TLR4、 Cat-k的表达。用脂多糖诱导人牙周膜干细胞的炎症反应，模拟牙周炎的炎症过程。采用cck-8法检测人牙周膜干细胞的活性。实时荧光定量PCR检测细胞中TNF-α、TLR4、Erk1、Erk2、P38、NF-κB基因的表达，同时运用免疫印迹分析检测细胞中Erk 、NF-κB蛋白的表达。

1. 实验性大鼠牙周炎模型建立及取材
本实验选用8周大雄性SD大鼠，共30只，体重200g±20g，聚丙烯合成塑料大鼠笼分笼饲养，每５只一笼，标准饲料由四川大学实验动物中心提供，自由饮水饮食。

大鼠随机分成3组，每组10只，两组用于牙周炎模型的建立，余一组作为正常对照组。用于建模的两组行7%水合氯醛(500mg/kg)腹膜下注射麻醉。用3-0无菌尼龙线结扎大鼠双侧上颌第一磨牙牙颈部，结扎丝线应该进入龈沟内，近中打结，便于实验过程中观察丝线是否脱落。药物处理：空白对照组（CON组），用食用级蜡和动物油调和的佐剂处理；对照组（L组），用佐剂处理；实验组（CBD组），用含20%CBD的佐剂处理。在吸入乙醚麻醉下处理CBD组实验大鼠，将药物均匀涂抹在大鼠上颌牙周组织周围，每天一次。饲养四周后乙醚麻醉下颈椎脱白处死所有动物，分离双侧上颌骨，一侧上颌骨组织置于0.5%多聚甲酸溶液中，用于Micro-CT扫描，另一侧上颌第一磨牙周围龈缘以下２mm的牙龈分离，用于蛋白质提取。

2. Micro-CT分析牙槽骨吸收
Micro-CT扫描及重建，测量各标本第一磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离(CEJ-AC), 即沿着第一磨牙颊舌侧牙根长轴测量，每个牙齿3个测量值(μm)，取其平均值作为CEJ-AC距离。使用CT机自带的分析软件计算骨体积。在扫描横截面上选第一磨牙与第二磨牙邻接面区域为选区，计算骨体积占总体积的百分比（BV/TV）。

3. 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测炎性蛋白的表达
收集上述大鼠牙龈组织，组织中总蛋白的提取。根据酶联免疫吸附试剂盒说明进行测定，在450nm读取各样品的吸光度，根据标准曲线计算炎性蛋白TNF-α、IL-1、TLR4、 Cat-k的含量。

4. 细胞培养
牙周膜细胞取自因正畸减数拔除的牙周组织健康的16～20岁志愿者的前磨牙（患者及家属均知情同意），PBS冲洗牙后，无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织，采用组织块法进行hPDLCs的原代培养，组织培养基（DMEM中添加0.1%Penicillin-Streptomycin Solution和10%FBS）每2天更换一次。待细胞从组织块中爬出并铺满培养板达80%时进行首次传代。本次研究采用第3代至第5代细胞。

5. CCK-8法检测细胞增殖
将hPDLCs接种于96孔板(5000个/孔，100μL)中。 用不同浓度(0.5、1、2、4、8μmol/L)的CBD处理细胞。于实验开始后1、3、5、7d用CCK-8法测定细胞浓度，以DMEM空白对照，评估介质中牙周膜细胞的存活状况，做出细胞增殖曲线, 根据公式：细胞活力=[A（加药）- A（空白）]/ [A（对照）- A（空白）] 计算出细胞活力，并以时间为x轴，细胞活力为y轴作图。

6. 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)技术测定炎性标志物的表达水平
将细胞以1*106的密度接种在6孔细胞培养板中。在含有10%FBS的DMEM中培养2天后将培养基改为不含FBS的DMEM饥饿1天，加入10mg/L的LPS以及不同浓度的CBD（0、1、2、4和8μmol/L；全谱CBD油含67% CBD，文中所有浓度按CBD纯品计量）。24小时后使用Trizol试剂提取各组的总细胞RNA，根据制造商的说明，使用Prime Script TM RT试剂盒（Takara，DRR037A）将2μg总RNA用于合成cDNA。RT-qPCR的条件如下：①95。C反应3分钟。②9。C 10秒；55。C 30秒，反应39个循环。重复测量3次，采用以下公式对目的基因进行相对定量计算ΔCT=CT (X) -CT (GAPDH) ，Y =2-ΔΔCT。

引物设计表

7. Western blot分析炎性蛋白的表达
将hPDLSCs以1*106的密度接种在6孔细胞培养板中。在含有10%FBS的DMEM中培养2天后将培养基改为不含FBS的DMEM饥饿1天，加入10mg/L的LPS以及8μmol/L的CBD。24小时后，用冷PBS洗涤hPDLSCs，用RIPA裂解缓冲液充分裂解细胞，13000g离心10min。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。总蛋白用SDS-PAGE凝胶分离，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶封闭PVDF膜，并在4℃下与一抗NF-Kb（1：800）、ERK(1:1000)、β-actin (1:1000)孵育过夜。用 TBST 冲洗PVDF膜4次(5min/次) 后置入相应的二抗(1:8000)中在室温下摇床孵育1h。 最后将膜洗涤4次(5 min /次)，发光，显影，定影。用Image-J软件定量分析。

8. 统计分析
统计分析采用SPSS 22.0和 GraphPad Prism 8.0软件。实验结果数值均以平均值±标准差的形式表示，采用单变量方差分析（ANOVA），用Tukey检验进行组间多重比较。以p<0.05为有统计学意义。

三、 研究结果

1. 全谱CBD油对实验性大鼠牙周炎模型的影响
采用Micro-CT三维成像技术来显示牙周炎所致的牙槽骨缺损程度。三组CEJ-AC测量结果分别为：CON组0.89±0.13mm，L组1.18±0.08mm，CDB组1.00±0.08mm。Micro-CT重建图显示丝线结扎导致第一磨牙周围出现明显的牙槽骨吸收。CBD治疗组CEJ-AC距离明显小于L组，表明CBD一定程度抑制了牙槽骨高度的丧失。(图1) 第一磨牙与第二磨牙邻接面下骨体积丧失程度，以所测区域骨体积占总体积的百分比指示（BV/TV），三组的比值分别是：0.80±0.09、0.53±0.04、0.61±0.02。CBD组BV/TV下降少于L组，说明CBD治疗能显著减少牙槽骨的丢失 (图1)

图解：Micro-CT扫描重建图，显示大鼠上颌第一磨牙舌侧和剖面牙槽骨吸收程度。与CON组相比，丝线结扎诱导实验性牙周炎大鼠L组和CBD实验组均表现出CEJ-AC距离的增大，且差异有统计学意义(####p<0.0001,与对照组比较)；L组CEJ-AC距离的增加显著于CBD组(****p<0.0001,与L组比较)。与CON组相比，L组和CBD组均表现出BV/TV减少，且差异有统计学意义(##p<0.01,与对照组比较)；L组BV/TV减少显著于CBD组(****p<0.0001,与L组比较)。数据均表示平均值±标准差（n=9）。

ELISA测定了牙龈组织中的TNF-α、IL-1β、TLR4、Cat-k。丝线结扎诱导的实验性牙周炎大鼠L组和CBD组均表现出炎性蛋白检出增多，并且结果显示CBD治疗显著的抑制了牙周炎引起的TNF-α、IL-1β、TLR4、Cat-k的增多。这些数据表明全谱CBD油可以抑制大鼠实验性牙周炎模型的炎症反应。（图2）。

图解：ELISA检测TNF-α、IL-1β、TLR4、Cat-k的变化。L组和CBD组均表现出炎性蛋白检出增多，且差异有统计学意义(#p<0.05，####p<0.0001,与CON组比较)。与L组的结扎动物相比， CBD组动物牙龈组织中的炎性细胞因子水平显著降低，差异有统计学意义(**p<0.01, ****p<0.0001,与L组比较)。数据均表示平均值±标准差（n=9）。

2. 全谱CBD油对人牙周膜细胞增殖的影响
牙周膜细胞经不同浓度CBD(0.5、1、2、4、8μmol/L)孵育1、3、5、7天后，CCK-8法所测吸光光度值在各组间无显著性差异，各组细胞活力无明显差异，说明实验中所用的各个浓度的CBD未影响牙周膜成纤维细胞的活性。在实验最长观察期内，CBD未对牙周膜成纤维细胞产生细胞毒性。（图3）

图解：不同浓度的CBD（0.5、1、2、4、8μmol/L）培育1、3、5、7天后，各组牙周膜细胞的活性无显著性差异（进行方差分析，p＞0.05）。说明在实验观察期内，所用的不同浓度的CBD对牙周膜细胞未产生细胞毒性。

3. 全谱CBD油对LPS刺激的人牙周膜细胞的影响
脂多糖是牙周炎发病机制中的关键毒性因素。因此，LPS刺激人牙周膜细胞24小时后能增加细胞中TNF-α、TLR4、P38、Erk1、Erk2、NF-KB（p65） RNA的转录水平,。RT-qPCR 结果显示，CBD能浓度依赖性的抑制LPS刺激引起的TNF-α、TLR4、Erk1、Erk2、P38、NF-KB转录水平的增加，浓度越大，抑制作用越明显。通过Western blot分析ERK、NF-KB蛋白在LPS刺激24 h 后的表达。与 qPCR 结果相符，CBD可抑制ERK以及NF-KB蛋白的产生，这些发现使我们得出结论: LPS剌激人牙周膜细胞后，通过与TLR4结合，可启动MAPK和NF-KB信号通路，与致炎细胞因子TNF-α的增多有关。而CBD抑制MAPK和NF-KB信号通路的活化，从而能减少TNF-α的表达，进一步抑制炎症的进一步放大。（图4）

图解：LPS刺激后，TNF-α、TLR4、P38、Erk1、Erk2、NF-KB表达上调 ， 且 LPS 对照组与空白对照组相比差异有统计学意义 (#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001,与对照组比较) 。加入CBD，随着CBD浓度的增加 TNF-α、TLR4、P38、Erk1、Erk2、NF-KB表达均下调，CBD浓度越大，下调越明显，且 LPS+CBD组与LPS组相比差异具有统计学意义(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001,与LPS组比较)。LPS刺激后，ERK、NF-KB蛋白表达上调，且 LPS刺激组与空白对照组相比差异有统计学意义 (**p<0.01，***p<0.001，与对照组比较)，加入CBD后ERK、NF-KB蛋白表达均下调，且 LPS+CBD组与LPS组相比差异具有统计学意义(#p<0.05, ##p<0.01，与LPS组比较)。数据均表示平均值±标准差（n=3）。

四、 研究结论：

现有的研究已证明牙周菌斑微生物是牙周病的始动因子，通过本身及其代谢产物直接参与破坏牙周组织，同时还通过抗原成分引起宿主对感染的免疫应答，进一步造成牙周组织损伤，是牙周组织破坏的重要原因。目前牙周炎的临床治疗技术都只是达到机械性去除牙菌斑以治疗牙周炎的目的，未涵盖到宿主的免疫反应这一重要环节对疾病发展的影响，通常还需辅以局部或全身药物治疗以巩固基础治疗疗效、阻断其发展。目前常用的牙周抗炎药物以硝基咪唑类、四环素类、青霉素类、大环内酯类等抗生素为主。由于长期使用抗生素副作用较大，对人体有不可避免的危害，因此医生及研究者更倾向于开发利用传统中成药或天然萃取物用于局部或全身的抗炎治疗。

已有研究证明CBD和全谱CBD油具有强大的免疫抑制和抗炎作用，可影响不同器官的各种疾病的发病机制。本研究证实全谱CBD油对实验性大鼠牙周炎模型的骨丢失有明显的抑制作用。此外，我们采用 LPS 作为炎症刺激因子，建立细胞损伤模型，发现CBD能浓度依赖性的抑制LPS刺激引起的TNF-α的产生。其抗炎机制可能与其抑制TLR4介导的NF-κB和MAPK信号通路有关。全谱CBD油可被认为是牙周病的治疗剂。

大鼠磨牙牙周组织的结构和组成与人的极为相似，因而常用于实验性牙周炎模型的建立。丝线结扎诱导的大鼠牙周炎模型被广泛的应用于牙周病学研究领域，丝线导致细菌在牙齿周围的聚集，进而引起牙周组织的炎症，与人体内牙周炎发病过程类似，因而得到广泛应用。为了评价CBD对炎症和牙槽骨丢失的影响，我们测量了牙龈中TNF-α、IL-1β、TLR4和Cat-k水平，并对上颌骨样本进行了Micro-CT扫描重建。Micro-CT分析显示，L组CEJ-AC的距离显著高于CBD组，CBD组BV/TV下降少于L组。上述结果均显示CBD治疗显著的抑制了牙槽骨吸收。已有研究表明，炎症介质 TNF-α和IL-1β的表达在牙周炎的发病机制中起着重要的作用。我们的结果表明，CDB治疗显著的抑制了牙周炎引起的TNF-α、IL-1β的表达，表明CBD具有一定的抗炎作用。TLR4是第一个对 LPS 作出反应的受体，TLR4对 LPS 的识别可以诱导NF-κB和 MAPK 的活化。我们的结果表明TLR4的表达在CBD组中被抑制，因此我们从TLR4入手，探讨了CBD参与牙周炎宿主炎症和牙周骨代谢调节的作用机制。

首先研究了CBD的细胞毒性。目前的数据表明，所用的最高浓度8μmol/L的CBD治疗对牙周膜细胞存活没有影响。TNF-α是牙周炎病理过程中的关键性的致炎细胞因子，它有始发和放大炎症反应的效果，在牙周组织破坏中起着重要作用，我们观察到CBD在体外能抑制LPS诱导的牙周膜细胞中TNF-α的产生，在体内也能抑制丝线结扎诱导的牙周炎引起的TNF-α增多，这可能是CBD阻止牙周破坏的机制之一。

以往的研究已经证明LPS和细菌通过介导TLRs的表达来促进TNF-α、 IL-1β的产生，这表明通过抑制 TLRs可以控制炎症介质的释放。TLRs的激活通常激活NF-κB和MAPK-ERK1/2信号通路，导致炎症基因表达上调，这对于炎症的先天免疫应答至关重要。本研究通过 LPS 刺激 hPDLSCs，诱导TLR4 /NF-κB信号通路上调，CBD处理后抑制TLR4 /NF-κB信号通路。LPS 刺激细胞可以诱导ERK1/2和 p38 MAPKs 的磷酸化和活化。本研究探讨了CBD 对 LPS 诱导的ERK1/2和 p38 MAPKs活化的影响。 结果表明，CBD对LPS诱导的NF-κB和 MAPK 活化有剂量依赖性的抑制作用。

综上所述，CBD减少了TNF-α和IL-1β的分泌，从而抑制了实验牙周炎模型的牙槽骨吸收。并且通过抑制TLR4介导的NF-κB和 MAPK 的激活减轻LPS 诱导的牙周膜细胞炎症反应。全谱CBD油可被认为是牙周病的潜在治疗剂。

目前的研究结果是在体外和大鼠模型中获得的，需要进一步的临床研究来验证CBD的临床应用效果。

本研究报告的数据仅针对送检产品的试验结果。未经四川大学、四川大学华西口腔医（学）院书面许可，不得在产品包装和宣传资料（包括对外公开会议手册、产品介绍光盘、商场海报等资料）上出现“四川大学华西口腔医学院（临床）验证”等字样。

项目负责人（签字）:

年 月 日